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直播答疑 | 難養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解決方法
來源:Pricella 瀏覽量: 發(fā)布時間:2022-08-02 10:18:38
培養(yǎng)出狀態(tài)良好的細(xì)胞,是實驗成功的第一步。在7月20日開播的“常見難養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)問題及解決方法”課程中,有很多老師就細(xì)胞培養(yǎng)提出了疑問。我們篩選出部分代表性問題,并作了詳細(xì)解答。
HCT 116細(xì)胞很難消化成單細(xì)胞懸液,請問怎么解決?
HCT 116細(xì)胞很好消化,一般消化1~2min就可以,但是由于細(xì)胞生長速度非常快,匯合度達(dá)到80%以上細(xì)胞就會開始擁擠,單個細(xì)胞形態(tài)變小,細(xì)胞之間的邊界變得模糊,這種過度擁擠的狀態(tài)會影響最后的消化分散效果。
要將細(xì)胞消化分散好,可以參考一下兩點建議進(jìn)行處理:
1. 培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度不要過高,80%~90%即可傳代,確保細(xì)胞不會過度密集;
2. 消化的時候胰酶量不要太多,一般T25瓶加1mL胰酶,輕輕晃動將瓶底覆蓋后吸出多余的胰酶,保留0.5mL左右胰酶消化,消化過程中不要晃動培養(yǎng)瓶,避免細(xì)胞沒分散好就從瓶底脫落。
從ATCC購得的HK-2細(xì)胞,傳2~3代就是狀態(tài)不好,細(xì)胞形態(tài)像碎了一樣,用的是DMEM/F12培養(yǎng)基和10%血清。請問怎么辦?
這是細(xì)胞培養(yǎng)條件適應(yīng)的問題,ATCC的HK-2使用的是無血清培養(yǎng)基K-SFM,突然更換成DMEM/F12+10%FBS來培養(yǎng),可能會出現(xiàn)細(xì)胞不適應(yīng)以及狀態(tài)變差的情況。正確的辦法是先用原本的培養(yǎng)條件K-SFM擴增好之后,再嘗試更換培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基時,建議先將兩種培養(yǎng)基按比例混合使用后,再慢慢更換成想要的培養(yǎng)基。
SF9必須用密閉的培養(yǎng)瓶嗎?
常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)時用到的DMEM、1640、F-12K等培養(yǎng)基緩沖體系為NaHCO3,需要用CO2進(jìn)行平衡,而培養(yǎng)SF9用的昆蟲培養(yǎng)基不含這種成分,在CO2存在的情況下會導(dǎo)致培養(yǎng)基變酸,影響細(xì)胞生長。所以SF9培養(yǎng)的環(huán)境是100%空氣,27℃~28℃,飽和濕度,直接將培養(yǎng)箱CO2濃度調(diào)為0即可,并非必須用密閉的培養(yǎng)瓶。
SP2/0養(yǎng)久了細(xì)胞狀態(tài)變差了,怎么辦?用什么樣的血清比較好?
細(xì)胞培養(yǎng)時間久了,狀態(tài)出現(xiàn)變化其實是比較常見的現(xiàn)象,細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要控制的變量太多,任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差或者培養(yǎng)失敗。一般建議在細(xì)胞傳代3~5代,狀態(tài)良好時進(jìn)行適當(dāng)凍存,后續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)異常情況也可以用凍存的細(xì)胞進(jìn)行補救。
選擇血清的標(biāo)準(zhǔn),就是能把手頭在養(yǎng)的細(xì)胞養(yǎng)好就行,所以選擇的方法就是在準(zhǔn)備更換血清批次前先用試用裝,確定該批次的血清培養(yǎng)自己的細(xì)胞是沒有問題的,然后再進(jìn)行購買。注意要在當(dāng)前批次血清用完之前就準(zhǔn)備下個批次血清的篩選,避免出現(xiàn)選取篩選效果不好又沒有合適血清使用的情況。
A498細(xì)胞用MEM培養(yǎng)的情況下,細(xì)胞出現(xiàn)腫脹破膜怎么處理?
細(xì)胞出現(xiàn)裂解死亡可以從以下三個方面進(jìn)行排查:
一是檢查細(xì)胞是否存在污染,細(xì)菌、真菌和支原體污染都有可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡;
二是檢查使用的培養(yǎng)基是否存在質(zhì)量問題。如PH值、滲透壓出現(xiàn)異常也會導(dǎo)致裂解死亡,但是一般實驗室沒有檢測條件,可以嘗試更換培養(yǎng)基廠家或批號進(jìn)行培養(yǎng),如果后續(xù)培養(yǎng)正常則可能是培養(yǎng)基原因?qū)е碌模?/p>
三是培養(yǎng)箱環(huán)境是否出現(xiàn)問題。如培養(yǎng)箱溫度過高,水盤干了等情況也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡,特別是培養(yǎng)箱水盤,如果干了會導(dǎo)致培養(yǎng)基蒸發(fā)加快,滲透壓升高從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。
一般細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束,使用結(jié)束后怎么處理或銷毀?
實驗室細(xì)胞培養(yǎng)用過的試劑和耗材等廢棄物都屬于危險廢棄物,處理方法是統(tǒng)一收集后,用專用的滅菌鍋消毒處理(如果沒有專用的滅菌鍋,就用84消毒液等進(jìn)行消毒后統(tǒng)一存放),然后交由有資質(zhì)進(jìn)行危廢處理的單位進(jìn)行處理,避免對環(huán)境造成污染。
我養(yǎng)的HK-2動不動就浮起來,漂浮后還可以離心收集培養(yǎng)嗎?
要看是用的什么培養(yǎng)條件培養(yǎng)的。如果是適應(yīng)了血清培養(yǎng)的HK-2貼壁正常,一般不容易漂;如果是K-SFM培養(yǎng)的HK-2,貼壁過程比較慢,也容易有漂浮的細(xì)胞。
K-SFM培養(yǎng)基因為沒有血清中促進(jìn)細(xì)胞貼壁的成分,所以培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞都會存在貼壁困難的情況,在培養(yǎng)前可以先用明膠或多聚賴氨酸等對培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被,增強細(xì)胞貼壁能力,另外在傳代之后2~3天盡量不要去移動細(xì)胞。
漂浮的細(xì)胞一般情況下是可以收集后繼續(xù)培養(yǎng)的,但是在培養(yǎng)基中懸浮時間太長可能會導(dǎo)致細(xì)胞活力慢慢下降。培養(yǎng)2~3天時,如果大部分細(xì)胞貼壁,只有少量懸浮可以不用處理;但是如果是大部分細(xì)胞懸浮,只有少量貼壁,可以在換液過程中把上清中的細(xì)胞離心后單獨處理。
如何能讓HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)皿中盡量長得滿一些,減少空隙?
Hep G2細(xì)胞的生長特點就是呈島狀生長,并且島狀生長的細(xì)胞擴張能力有限,長到一定大小之后就會堆積生長。要想細(xì)胞分散均勻,一方面是需要保證細(xì)胞消化過程中分散良好,另外一方面接種的初始密度不宜過低,否則就會有大面積的空白區(qū)域。
另外如果實驗需要Hep G2為分散良好的單層細(xì)胞,可以用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶后培養(yǎng),細(xì)胞將會呈單層分散的形式生長,但是形態(tài)跟不包被時差異比較大,會變成長梭形細(xì)胞。
消化完后是用完全培養(yǎng)基還是不完全培養(yǎng)基終止消化的呀?
一般細(xì)胞用胰酶消化完之后使用完全培養(yǎng)基中止,起作用的主要是其中的血清成分,可以抑制胰酶的活性,所以理論上講也是可以直接用血清中止,只是比較浪費。另外如果培養(yǎng)的細(xì)胞是用的無血清培養(yǎng)基,那么在中止時就不能使用完培中止,而應(yīng)該選用胰酶抑制劑。
懸浮細(xì)胞的增殖正常,但是細(xì)胞形態(tài)很不一致,有形成突觸樣的形狀,不呈現(xiàn)橢圓形,這是什么原因呢?
這要看具體是什么細(xì)胞,如果細(xì)胞本身就存在少量不同形狀的細(xì)胞,則是正常;如果原本形態(tài)正常,但是突然出現(xiàn)形狀變化,可能是培養(yǎng)條件改變導(dǎo)致的,需要在更換培養(yǎng)條件時注意。
細(xì)胞正常的形態(tài)圖片可以從兩個途徑獲取,一是在購買細(xì)胞的機構(gòu)官網(wǎng)查詢,或索要細(xì)胞正常狀態(tài)圖片進(jìn)行參考;二是可以查詢國內(nèi)外權(quán)威的數(shù)據(jù)庫,可以參考:https://web.expasy.org/cellosaurus。